کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

این فناوری که کروماتوگرافی مایع با فشار بالا نیز نامیده می شد، یک روش تحلیلی در شیمی است. HPLC یک روش کروماتوگرافی مایع است که نه تنها مواد را جدا می کند، بلکه آنها را با استفاده از استانداردها (تعیین غلظت دقیق) شناسایی و کمیت می کند. برخلاف کروماتوگرافی گازی که روش جداسازی بسیار خوبی برای مواد قابل تبخیر است، مواد غیرفرار را نیز می توان با استفاده از HPLC آنالیز کرد.

 

عملکرد HPLC

این یک فرآیند جداسازی کروماتوگرافی است که در آن ماده مورد بررسی از طریق یک ستون به اصطلاح جداسازی که شامل فاز ثابت همراه با یک فاز متحرک (همچنین به نام “شباع کننده” یا “شوینده” نیز نامیده می شود، پمپ می شود. یک ستون جداسازی در دستگاه HPLC بین 18 تا 300 میلی متر طول دارد و در مورد سیستم های HPLC تحلیلی عمدتاً دارای قطر داخلی 2 تا 4.6 میلی متر است. قدرت جداسازی HPLC حدود 100 برابر بیشتر از کروماتوگرافی ستونی است.

به دلایل اقتصادی، یک فیلتر به اصطلاح پیش ستون یا فیلتر ستون اغلب در بالادست نصب می شود. این یک ستون کوتاه یا یک دیسک فیلتر است که از همان مواد ستون جداسازی ساخته شده است تا آلاینده ها را از ستون اصلی دور نگه دارد. HPLC همچنین برای خالص سازی مواد به عنوان HPLC آماده سازی (نیمه) استفاده می شود. قطر داخلی می تواند به طور قابل توجهی بزرگتر باشد، زیرا تصفیه می تواند تا مقیاس تولید انجام شود. ستون های آماده سازی برای مقیاس آزمایشگاهی دارای قطر 10 یا 25 میلی متر هستند.

ساختار یک دستگاه HPLC معمولی که به عناصر ضروری کاهش یافته است، در شکل زیر دیده می شود. با توجه به اصل جداسازی، بین فاز نرمال (NP)، فاز معکوس (RP)، تبادل یونی (IEC) و کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) و همچنین جداسازی انانتیومر (کروماتوگرافی کایرال) تمایز قائل می‌شود.

اگر یک جزء از ماده مورد بررسی به شدت با فاز ساکن تعامل داشته باشد، برای مدت نسبتا طولانی در ستون باقی می ماند. از طرف دیگر، اگر با فاز ساکن برهمکنش ضعیفی داشته باشد، زودتر از ستون خارج می شود. بسته به قدرت این فعل و انفعالات، اجزای تشکیل دهنده ماده در زمان‌های مختلف (زمان‌های ماندگاری) در انتهای ستون جداسازی ظاهر می‌شوند و سپس با یک آشکارساز مناسب می‌توان آنها را شناسایی کرد. برای فاز معکوس، زمان ماند یک ماده به زمان باقی ماندن آن در فاز ثابت (فیلم حلال در اطراف زنجیره های آلکیل سیلیکاژل اصلاح شده) بستگی دارد. مرحله ای که نرخ را تعیین می کند “انحلال” (داجذب) به فاز متحرک است.

یک فاز ثابت قطبی (به عنوان مثال سیلیکاژل / سیلیکاژل) در NP-HPLC استفاده می شود. قدرت خروجی فاز متحرک به طور کلی به قطبیت بستگی دارد. هرچه فاز متحرک قطبی تر باشد، ماده سریعتر شسته می شود. مولکول های قطبی نسبت به مولکول های غیرقطبی مدت زمان بیشتری روی ستون جذب / کند می شوند (حفظ می شوند) و بنابراین بعداً ستون را ترک می کنند. فازهای معمولی این عیب را دارند که معمولاً فقط با حلال‌های آلی می‌توان کار کرد و نه با مواد شوینده آبی. کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفیلی (HILIC) راهی برای برون رفت از این مشکل ارائه می دهد. در HILIC، فازهای ثابت قطبی به طور مشابه با انتخاب NP استفاده می‌شوند، اما آنها به عنوان شوینده با سیستم‌های بافر آبی کار می‌کنند. با این حال، برخلاف کروماتوگرافی RP، آب قوی‌ترین ماده شوینده در HILIC است.

RP-HPLC رایج ترین روش در عمل است. حدود 70 درصد از تمام جداسازی های HPLC تحلیلی جداسازی RP است. در اینجا از یک فاز ثابت غیر قطبی استفاده می شود و قدرت شستشوی فاز متحرک با افزایش قطبیت کاهش می یابد. فاز ساکن با واکنش سیلان هایی که با هیدروکربن های زنجیره بلند با سیلیکاژل جایگزین شده اند تولید می شود. سطح قطبی ذرات سیلیکاژل با یک لایه غیر قطبی از آلکان ها پوشیده شده است، یعنی قطبیت کاهش می یابد. معمولاً از مخلوط آب مقطر یا بافر و استونیتریل یا متانول به عنوان فاز متحرک استفاده می شود. در جداسازی های ایزوکراتیک، ترکیب فاز متحرک در تمام مدت یکسان باقی می ماند. در مورد جداسازی گرادیان، قطبیت مخلوط حلال در طول تجزیه و تحلیل تغییر می کند.

RP-HPLC به ویژه برای جداسازی آنالیت‌های قطبی استفاده می‌شود، که زمان‌های ماندگاری زیادی در فازهای عادی دارند. تشخیص بیشتر با استفاده از آشکارساز UV یا فلورسانس انجام می شود. ترکیبات با طیف‌سنج‌های جرمی ساده (MS) یا طیف‌سنج‌های جرمی پشت سر هم بیشتر و بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرند.

ساختار کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا
ساختار کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

اجزا دستگاه HPLC

A= مخزن شوینده
B = شیرهای مخلوط الکترومغناطیسی با پمپ دو پیستونی
C = شیر 6 طرفه
D = حلقه جبران فشار برای یکسان سازی تکانه های پمپ از پمپ
E = محفظه اختلاط
F = انژکتور دستی
G = ستون جداسازی
H = واحد HPLC
I = واحد آشکارساز (به عنوان مثال طیف سنج UV)
J = رابط کامپیوتر
K = PC
L = چاپگر برای خروجی نتایج

دیاگرام کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا
دیاگرام کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

کاربردهای عملی HPLC

یک ترکیب شیمیایی با استفاده از HPLC تنها با مقایسه زمان ماند ماده ناشناخته با یک استاندارد (یک ماده شناخته شده) (استانداردسازی خارجی) به میزان محدودی قابل شناسایی است. اگر زمان ماندگاری یکسان است، می توانید کمی استاندارد به نمونه با ماده ناشناخته اضافه کنید و بررسی کنید که آیا فقط یک پیک هنوز در کروماتوگرام قابل مشاهده است، آیا یک “قله دوگانه” ایجاد شده است یا اینکه کروماتوگرام دو “قله” جداگانه دارد یا خیر. ” با زمان‌های نگهداری بسیار مشابه قابل مشاهده می‌شوند (استانداردسازی داخلی).

اگر پس از افزودن استاندارد به نمونه فقط یک نوک قابل مشاهده باشد، نمی توان فرض کرد که ترکیب شیمیایی موجود در نمونه و استاندارد یکسان است. پارامتر دیگر مقایسه طیف UV هنگام استفاده از آشکارساز آرایه دیودی یا ردیابی جرم با یک طیف سنج جرمی جفت شده است. با این حال، زمان ماند، طیف UV و طیف MS برای ایزومرها اغلب فقط ویژگی های شناسایی ناکافی را ارائه می دهند. در عمل، این تکنیک تنها می تواند شناسایی کارآمد را با کنار گذاشتن سایر احتمالات به خوبی تسهیل کند.

روش دیگر، این آزمایش را می توان تحت دو شرایط جداسازی مختلف (به عنوان مثال جداسازی HPLC با دو ستون مختلف) انجام داد. بنابراین می توانید ترکیبات شیمیایی ناشناخته را با درجه خاصی از اطمینان شناسایی کنید. اگر می خواهید غلظت یک ماده شیمیایی (مثلا ویتامین E در روغن نباتی) را تعیین کنید، می توانید با تهیه استانداردهای این ماده شیمیایی با غلظت های شناخته شده و سطح پیک استانداردها با مناطق پیک مقایسه کنید.

مانند هر روش تحلیلی، باید دقت شود که هنگام پردازش نمونه، میزان بازیابی در محاسبه غلظت لحاظ شود. جداسازی کروماتوگرافی منحصراً برای اهداف تحلیلی استفاده نمی شود، بلکه برای اهداف آماده سازی در آزمایشگاه و در صنایع شیمیایی به منظور خالص سازی یک محصول (مانند پروتئین ها) یا جداسازی مواد بسیار مشابه (مانند انانتیومرها) از یکدیگر استفاده می شود. در اینجا از ستون هایی با قطر تا یک متر استفاده می شود.

 

توسعه روش HPLC

جداسازی مواد به پارامترهای زیادی بستگی دارد که عبارتند از: نوع مواد، نوع و ابعاد ستون جداسازی، ترکیب فاز متحرک، درجه حرارت، نرخ جریان فاز سیار و PH.

برای دستیابی به یک جداسازی کامل و قابل تکرار، معمولاً باید یک روش جداگانه برای هر مخلوط پیچیده تر از مواد، به ویژه با روش گرادیان، ایجاد شود. حتی انحراف جزئی از یک روش می تواند به معنای تغییر در انتخاب باشد. هدف از توسعه روش، کروماتوگرام است که در آن تمام پیک ها به طور کامل از هم جدا می شوند، اما در حداقل فاصله از یکدیگر ظاهر می شوند تا مدت زمان فرآیند جداسازی تا حد امکان کوتاه باشد. به منظور عدم تعیین پارامترها به روشی زمان‌بر و پرهزینه از طریق آزمون و خطا، صنایع شیمیایی، دارویی و غذایی اغلب از نرم‌افزار شبیه‌سازی استفاده می‌کنند که می‌تواند روش‌های مناسب را بر اساس داده‌های تجربی یا ساختار مولکولی نمونه‌ها پیش‌بینی کند.